(3) 色氨酸的测定-荧光分光光度法: 1.原理
食物中蛋白质中的色氨酸在酸水解过程中很容易分解。该方法利用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解物中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。在pH 11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100倍，两种氨基酸的荧光峰相差40 nm。利用这一特性，可以在存在大量酪氨酸的情况下检测色氨酸。内容。
2。适用范围
参见中国疾病预防控制中心营养与食品安全所编写的《食品成分检测分析手册》。适用于食品中色氨酸的测定。
3。试剂
(1)5mol/L NaOH，含0.5%可溶性淀粉，临用前配制。
(2) 4mol/L尿素(pH11)。
(3) 6mol/L HCl。
（4）溴百里酚蓝指示剂，称取溴百里酚蓝0.1g，加0.1mol/L氢氧化钠1.6mL，配制成0.05%的水溶液。
(5) 高纯氮气（含量99.999%）。
(6)辛醇甲苯溶液，含1%辛醇。
（7）色氨酸标准溶液（1mg/mL），称取色氨酸标准品100mg，用0.005mol/L NaOH溶液溶解，稀释至100mL，冰箱保存。
4。仪器
(1)荧光分光光度计。
(2) 减压蒸发器。
(3) 带螺旋盖的大口瓶（瓶盖必须有橡胶垫圈）。
(4) PTFE 管。
(5) 小玻璃球。
(6) 烤箱。
5。操作步骤
（1）称取约含粗蛋白5mg的食品样品，置于聚四氟乙烯管中，加入1mL含可溶性淀粉的5mol/L氢氧化钠，并加入1滴辛醇甲苯溶液。
(2)将每个管子盖上一个小玻璃球，放入带螺帽的大口玻璃瓶中，将瓶子放入减压蒸发装置中，加冰和盐冷却，降低压力到真空。 1.3kPa（10mmHg）以下，继续维持15分钟，充氮气然后减压，重复3次，迅速拧紧大口瓶螺帽。
(3) 将充氮罐放入烘箱中，将样品在110℃下水解22小时。
(4)冷却大口瓶，用重蒸水冲洗样品至25mL容量瓶(含0.7mL 6mol/L HCl)中。以溴百里酚蓝为指示剂，调节pH至中性。将水蒸馏至刻度。
(5) 取样品溶液1mL，置于10mL有盖试管中，用pH 11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm，发射波长为360mm。根据标准色氨酸溶液的荧光强度曲线，计算样品中色氨酸的含量。
（6）色氨酸标准溶液：（1mg/mL）：称取色氨酸标准品，用0.005mol/L氢氧化钠溶液溶解，冰箱保存。使用前，将标准储备液稀释成每毫升含100、200、300和400 μg色氨酸的标准系列。取各浓度标准溶液1 mL（一式两份），加入相同试剂至样品管中，同时水解。以色氨酸标准浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
6。结果计算
式中 m——根据标准曲线求得每1mL测定溶液中色氨酸的含量，mg；
f——稀释系数；
m1——样品质量，g。
食物中蛋白质中的色氨酸在酸水解过程中很容易分解。该方法利用碱水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光。在蛋白质水解物中，只有色氨酸和酪氨酸可以检测到荧光。在pH 11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100倍，两种氨基酸的荧光峰相差40 nm。利用这一特性，可以在存在大量酪氨酸的情况下检测色氨酸。内容。
2。适用范围
参见中国疾病预防控制中心营养与食品安全所编写的《食品成分检测分析手册》。适用于食品中色氨酸的测定。
3。试剂
(1)5mol/L NaOH，含0.5%可溶性淀粉，临用前配制。
(2) 4mol/L尿素(pH11)。
(3) 6mol/L HCl。
（4）溴百里酚蓝指示剂，称取溴百里酚蓝0.1g，加0.1mol/L氢氧化钠1.6mL，配制成0.05%的水溶液。
(5) 高纯氮气（含量99.999%）。
(6)辛醇甲苯溶液，含1%辛醇。
（7）色氨酸标准溶液（1mg/mL），称取色氨酸标准品100mg，用0.005mol/L NaOH溶液溶解，稀释至100mL，冰箱保存。
4。仪器
(1)荧光分光光度计。
(2) 减压蒸发器。
(3) 带螺旋盖的大口瓶（瓶盖必须有橡胶垫圈）。
(4) PTFE 管。
(5) 小玻璃球。
(6) 烤箱。
5。操作步骤
（1）称取约含粗蛋白5mg的食品样品，置于聚四氟乙烯管中，加入1mL含可溶性淀粉的5mol/L氢氧化钠，并加入1滴辛醇甲苯溶液。
(2)将每个管子盖上一个小玻璃球，放入带螺帽的大口玻璃瓶中，将瓶子放入减压蒸发装置中，加冰和盐冷却，降低压力到真空。 1.3kPa（10mmHg）以下，继续维持15分钟，充氮气然后减压，重复3次，迅速拧紧大口瓶螺帽。
(3) 将充氮罐放入烘箱中，将样品在110℃下水解22小时。
(4)冷却大口瓶，用重蒸水冲洗样品至25mL容量瓶(含0.7mL 6mol/L HCl)中。以溴百里酚蓝为指示剂，调节pH至中性。将水蒸馏至刻度。
(5) 取样品溶液1mL，置于10mL有盖试管中，用pH 11的4mol/L尿素溶液稀释至刻度，在激发波长为280nm，发射波长为360mm。根据标准色氨酸溶液的荧光强度曲线，计算样品中色氨酸的含量。
（6）色氨酸标准溶液：（1mg/mL）：称取色氨酸标准品，用0.005mol/L氢氧化钠溶液溶解，冰箱保存。使用前，将标准储备液稀释成每毫升含100、200、300和400 μg色氨酸的标准系列。取各浓度标准溶液1 mL（一式两份），加入相同试剂至样品管中，同时水解。以色氨酸标准浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
6。结果计算
式中 m——根据标准曲线求得每1mL测定溶液中色氨酸的含量，mg；
f——稀释系数；
m1——样品质量，g。