(1) 氨基酸自动分析仪方法： 1、原理
食物蛋白质被盐酸水解成游离氨基酸。经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液发生显色反应，然后用分光光度计比色测定氨基酸含量。一种水解产物可以同时测量天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和酪氨酸。 、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等16种氨基酸，最低检测限为10pmol。
2。适用范围
GB/T 5009.124-2003 本方法适用于食品中16种氨基酸的测定。其最低检测限为 10 pmol。本方法不适用于水果、蔬菜、饮料和蛋白质含量低的淀粉类食品的测定。
3。试剂
除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
(1)浓盐酸(HCl)：优级纯。
(2) 6mol/L HCl：浓盐酸与水1:1混合。
(3) 苯酚：需要重新蒸馏。
（4）混合氨基酸标准溶液（仪器制造公司销售）：0.0025mol/L。
(5) 缓冲区。
① pH 2.2 的柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠 (Na3 C6 H5 O7·2H2 O) 和 16.5mL 浓盐酸，加水稀释定容至1000mL，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
② pH 3.3 柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 12mL 浓盐酸，用水稀释至 1000mL，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调节 pH 至 3.3。
③ pH 4.0 柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 9mL 浓盐酸，用水稀释至 1000mL，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调节 pH 至 4.0。
④ pH 6.4 柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 46.8g 氯化钠（优级纯），加水稀释至 1000mL，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调节 pH 至 1000mL 。 6.4.
(6) 茚三酮溶液。
①pH 5.2的醋酸锂溶液：称取168g氢氧化锂（LiOH·H2O），加入279mL冰醋酸（优级纯），加水稀释至1000mL，用浓盐酸或50% NaOH 将 pH 调节至 5.2。
②茚三酮溶液：取150mL二甲亚砜(C2H6OS)和50mL乙酸锂溶液，加入4g水合茚三酮(C9H4O3·H2O）和0.12克还原茚三酮（C18H10O6·2H2O）搅拌直至完全溶解。
(7)高纯氮气：纯度99.99%。
(8)制冷剂：将市售盐与冰按1：3的比例混合。
4。仪器设备
(1) 真空泵。
(2)恒温干燥箱。
(3) 水解管。
(4)耐压螺口玻璃管或硬质玻璃管，容量20~30mL。
(5)真空干燥机（温度可调）。
(6)氨基酸自动分析仪。
5。操作步骤
（1）样品处理：采集样品后，用均质机将其均质（或尽可能粉碎样品），并在低温冰箱中冷冻。分析期间使用前将其解冻。
(2)称量：准确称取一定量的样品，精确至0.0001g。对于均匀性好的样品，如奶粉等，样品的蛋白质含量应在10～20mg范围内。对于均匀性较差的样品，如新鲜肉类，可适当增加称量量以减少误差，并在测量前稀释。将称重的样品放入水解管中。
（3）水解：在水解管中加入10~15mL 6mol/L盐酸（加酸量根据样品蛋白质含量而定）。对于含水量较高的样品（如牛奶），可加入等体积的浓盐酸，并可加入淡水。加入3～4滴蒸馏苯酚，然后将水解管放入制冷剂中，冷冻3～5分钟，然后连接到真空泵的排气管，抽真空（1333.22～2666.44Pa），然后填充具有高纯度氮气；再次抽真空充氮，重复3次，充氮的同时密封或拧紧螺帽，将密封的水解管放入（110±1）℃恒温干燥箱中水解22小时，然后取出，冷却。
打开水解管，过滤水解液，用去离子水冲洗水解管数次，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用去离子水定容。吸取1 mL滤液放入5 mL容量瓶中，用真空干燥器在40-50℃下干燥。将残渣用1-2mL水溶解，再次干燥，重复此过程两次，最后蒸干，用1mL pH 2.2的缓冲溶液溶解。用于仪器测量。
(4)测定：准确吸取0.200mL混合氨基酸标准品，用pH2.2缓冲液稀释至5mL，该标准品稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为机上氨基酸标准品测定，并采用氨基酸自动分析仪器采用外标法测定样品溶液中的氨基酸含量。
（5）允许偏差：同一实验室平行测量或连续两次测量的相对偏差绝对值≤12%。
6。计算
所以：
其中 106——从ng转换为mg；
f——样品的稀释倍数；
mr——氨基酸的相对分子质量；
m——样品质量，g；
V——上机时的注射量（此处为50μL）。
[注：①样品中氨基酸含量低于1.00g/100g时，保留两位有效数字；含量大于1.00g/100g时，保留三位有效数字。 ②16种氨基酸相对分子量：天冬氨酸：133.1、苏氨酸：119.1、丝氨酸：105.1、谷氨酸：147.1、脯氨酸：115.1、甘氨酸：75.1、丙氨酸：89.1、缬氨酸：117.2、蛋氨酸：149.2、异亮氨酸：131。 2、亮氨酸：131.2，酪氨酸：181.2，苯丙氨酸：165.2，组氨酸：155.2，赖氨酸：146.2，精氨酸：174.2。 ]
7。其他的
(1) 测定条件（以Beckman-6300全自动氨基酸分析仪为例）
缓冲流量：20mL/h；
茚三酮流量：10mL/h；
柱温：50、60、70℃；
立柱：20cm；
分析时间：42分钟。
(2) 标准峰序和保留时间如下。
(3)标准图：如图3-2所示。
食物蛋白质被盐酸水解成游离氨基酸。经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液发生显色反应，然后用分光光度计比色测定氨基酸含量。一种水解产物可以同时测量天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和酪氨酸。 、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等16种氨基酸，最低检测限为10pmol。
2。适用范围
GB/T 5009.124-2003 本方法适用于食品中16种氨基酸的测定。其最低检测限为 10 pmol。本方法不适用于水果、蔬菜、饮料和蛋白质含量低的淀粉类食品的测定。
3。试剂
除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
(1)浓盐酸(HCl)：优级纯。
(2) 6mol/L HCl：浓盐酸与水1:1混合。
(3) 苯酚：需要重新蒸馏。
（4）混合氨基酸标准溶液（仪器制造公司销售）：0.0025mol/L。
(5) 缓冲区。
① pH 2.2 的柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠 (Na3 C6 H5 O7·2H2 O) 和 16.5mL 浓盐酸，加水稀释定容至1000mL，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
② pH 3.3 柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 12mL 浓盐酸，用水稀释至 1000mL，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调节 pH 至 3.3。
③ pH 4.0 柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 9mL 浓盐酸，用水稀释至 1000mL，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调节 pH 至 4.0。
④ pH 6.4 柠檬酸钠缓冲液：称取 19.6g 柠檬酸钠和 46.8g 氯化钠（优级纯），加水稀释至 1000mL，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶液调节 pH 至 1000mL 。 6.4.
(6) 茚三酮溶液。
①pH 5.2的醋酸锂溶液：称取168g氢氧化锂（LiOH·H2O），加入279mL冰醋酸（优级纯），加水稀释至1000mL，用浓盐酸或50% NaOH 将 pH 调节至 5.2。
②茚三酮溶液：取150mL二甲亚砜(C2H6OS)和50mL乙酸锂溶液，加入4g水合茚三酮(C9H4O3·H2O）和0.12克还原茚三酮（C18H10O6·2H2O）搅拌直至完全溶解。
(7)高纯氮气：纯度99.99%。
(8)制冷剂：将市售盐与冰按1：3的比例混合。
4。仪器设备
(1) 真空泵。
(2)恒温干燥箱。
(3) 水解管。
(4)耐压螺口玻璃管或硬质玻璃管，容量20~30mL。
(5)真空干燥机（温度可调）。
(6)氨基酸自动分析仪。
5。操作步骤
（1）样品处理：采集样品后，用均质机将其均质（或尽可能粉碎样品），并在低温冰箱中冷冻。分析期间使用前将其解冻。
(2)称量：准确称取一定量的样品，精确至0.0001g。对于均匀性好的样品，如奶粉等，样品的蛋白质含量应在10～20mg范围内。对于均匀性较差的样品，如新鲜肉类，可适当增加称量量以减少误差，并在测量前稀释。将称重的样品放入水解管中。
（3）水解：在水解管中加入10~15mL 6mol/L盐酸（加酸量根据样品蛋白质含量而定）。对于含水量较高的样品（如牛奶），可加入等体积的浓盐酸，并可加入淡水。加入3～4滴蒸馏苯酚，然后将水解管放入制冷剂中，冷冻3～5分钟，然后连接到真空泵的排气管，抽真空（1333.22～2666.44Pa），然后填充具有高纯度氮气；再次抽真空充氮，重复3次，充氮的同时密封或拧紧螺帽，将密封的水解管放入（110±1）℃恒温干燥箱中水解22小时，然后取出，冷却。
打开水解管，过滤水解液，用去离子水冲洗水解管数次，将水解液全部转移至50mL容量瓶中，用去离子水定容。吸取1 mL滤液放入5 mL容量瓶中，用真空干燥器在40-50℃下干燥。将残渣用1-2mL水溶解，再次干燥，重复此过程两次，最后蒸干，用1mL pH 2.2的缓冲溶液溶解。用于仪器测量。
(4)测定：准确吸取0.200mL混合氨基酸标准品，用pH2.2缓冲液稀释至5mL，该标准品稀释浓度为5.00nmol/50μL，作为机上氨基酸标准品测定，并采用氨基酸自动分析仪器采用外标法测定样品溶液中的氨基酸含量。
（5）允许偏差：同一实验室平行测量或连续两次测量的相对偏差绝对值≤12%。
6。计算
所以：
其中 106——从ng转换为mg；
f——样品的稀释倍数；
mr——氨基酸的相对分子质量；
m——样品质量，g；
V——上机时的注射量（此处为50μL）。
[注：①样品中氨基酸含量低于1.00g/100g时，保留两位有效数字；含量大于1.00g/100g时，保留三位有效数字。 ②16种氨基酸相对分子量：天冬氨酸：133.1、苏氨酸：119.1、丝氨酸：105.1、谷氨酸：147.1、脯氨酸：115.1、甘氨酸：75.1、丙氨酸：89.1、缬氨酸：117.2、蛋氨酸：149.2、异亮氨酸：131。 2、亮氨酸：131.2，酪氨酸：181.2，苯丙氨酸：165.2，组氨酸：155.2，赖氨酸：146.2，精氨酸：174.2。 ]
7。其他的
(1) 测定条件（以Beckman-6300全自动氨基酸分析仪为例）
缓冲流量：20mL/h；
茚三酮流量：10mL/h；
柱温：50、60、70℃；
立柱：20cm；
分析时间：42分钟。
(2) 标准峰序和保留时间如下。
| 编号 | 峰值顺序 | 保留时间/分钟 | 编号 | 峰值顺序 | 保留时间/分钟 |
| 1 | 天冬氨酸 | 5. 55 | 9 | 蛋氨酸 | 19.63 |
| 2 | 苏氨酸 | 6.60 | 10 | 异亮氨酸 | 21.24 |
| 3 | 丝氨酸 | 7.09 | 11 | 亮氨酸 | 2 2.06 |
| 4 | 谷氨酸 | 8.72 | 12 | 酪氨酸 | 24.52 |
| 5 | 脯氨酸 | 9.63 | 13 | 苯丙氨酸 | 25.76 |
| 6 | 甘氨酸 | 12.24 | 14 | 组氨酸 30.41 | |
| 7 | 丙氨酸 | 13.10 | 15 | 赖氨酸 | 32.57 |
| 8 | 缬氨酸 | 16.65 | 16 | 精氨酸 | 4 0.75 |
(3)标准图：如图3-2所示。
图3-2氨基酸标准图